Colonne a Membrana di Silice: Principi, Architettura a Strati e Ottimizzazione per la Purificazione degli Acidi Nucleici
Colonne a Membrana di Silice: Principi, Architettura a Strati e Ottimizzazione per la Purificazione degli Acidi Nucleici
La purificazione degli acidi nucleici figura tra i flussi di lavoro eseguiti con maggiore frequenza nella biologia molecolare moderna; tuttavia, la colonna al centro di tale flusso di lavoro—la colonna a membrana di silice—risulta spesso poco compresa. Ogni anno, nei laboratori si sprecano ore per risolvere problemi di basse rese, rapporti A260/A280 scadenti e reazioni a valle fallite, laddove la causa principale è spesso da ricondursi a una mancata corrispondenza tra l'architettura della colonna e l'applicazione. Nel presente articolo si esamina la chimica fisica che governa il legame degli acidi nucleici mediato dalla silice, si analizza come il numero di strati determini le prestazioni in diversi compiti di purificazione e si illustra come selezionare e ottimizzare i parametri della colonna per ottenere risultati coerenti e di qualità pubblicabile.
Indice
- La Chimica del Legame degli Acidi Nucleici Mediato dalla Silice
- Architettura a Strati: Area Superficiale, Resistenza al Flusso e il Compromesso Legame-Eluizione
- Tre Configurazioni e la Loro Logica Biochimica
- Colonne di Silice vs. Metodi di Purificazione Alternativi
- Ottimizzazione del Protocollo: pH, Concentrazione di Caotropo e Trascinamento di Etanolo
- Problemi Comuni e Risoluzione Basata sull'Evidenza
- Matrice Decisionale di Selezione
- Risorse Aggiuntive
1. La Chimica del Legame degli Acidi Nucleici Mediato dalla Silice
Il principio fondamentale alla base di tutte le purificazioni di acidi nucleici basate su silice è ingannevolmente semplice: in presenza di elevate concentrazioni di sali caotropici, il DNA e l'RNA si legano selettivamente e reversibilmente alle superfici di silice. Questa osservazione fu sfruttata sistematicamente per la prima volta da Boom e colleghi, che nel 1990 dimostrarono l'isolamento di acidi nucleici da campioni clinici mediante particelle di silice e guanidina tiocianato (GuSCN). Tale metodo trasformò la biologia molecolare, sostituendo la pericolosa e laboriosa estrazione con fenolo-cloroformio che era stato lo standard di riferimento sin dagli anni '50.
Il meccanismo opera mediante una combinazione di effetti di disidratazione e di carica. Secondo la serie di Hofmeister, gli ioni guanidinio e ioduro sono fortemente caotropici—distruggono la rete idrica legata da ponti a idrogeno che solvata sia la superficie della silice sia lo scheletro fosfatico dell'acido nucleico. A concentrazioni di GuSCN o guanidina cloridrato (GuHCl) di 4–6 M, lo strato d'acqua strutturato che circonda lo scheletro fosfodiestereo del DNA, caricato negativamente, viene rimosso, esponendo i gruppi fosfato. Contemporaneamente, la superficie della silice (SiO2), che a pH neutro presenta gruppi silanolo (Si–OH) parzialmente deprotonati a silossido (Si–O−), perde il suo guscio di idratazione. L'ambiente risultante ad alta forza ionica scherma la repulsione elettrostatica tra il DNA carico negativamente e la superficie della silice, mentre la struttura dell'acqua disturbata dal caotropo crea una condizione termodinamicamente favorevole per il contatto DNA-silice tramite legami a idrogeno tra gli ossigeni fosfatici e i gruppi silanolo superficiali, integrati da interazioni di van der Waals più deboli.
La forza motrice termodinamica per questo legame fu caratterizzata mediante calorimetria a titolazione isotermica. L'associazione è guidata prevalentemente dall'entropia—il rilascio di molecole d'acqua ordinate da entrambe le superfici del DNA e della silice al momento del legame supera il costo entalpico dell'interazione DNA-silice. Ciò spiega perché l'efficienza di legame aumenti con la temperatura nell'intervallo 15–37 °C: una maggiore energia termica facilita lo spostamento dell'acqua. La costante di legame (Ka) è approssimativamente 106–107 M−1 in condizioni ottimali di caotropo, rendendo l'interazione sufficientemente forte per la cattura (>95% tipicamente trattenuto sulla membrana) ma reversibile in seguito a reidratazione con tampone a bassa forza ionica.
L'inversione—l'eluizione—è semplicemente l'inverso termodinamico. Man mano che il caotropo viene rimosso mediante lavaggio e sostituito con un tampone a bassa forza ionica (tipicamente Tris-EDTA a pH 8,0–8,5 o acqua priva di nucleasi), la struttura dell'acqua attorno sia al DNA sia alla silice si riforma. I legami a idrogeno tra gli ossigeni fosfatici del DNA e i gruppi silanolo della silice vengono spostati competitivamente dalle molecole d'acqua, e il DNA viene rilasciato in soluzione. Il riscaldamento del tampone di eluizione a 55–70 °C accelera questo processo aumentando la mobilità dell'acqua e riducendo la barriera di attivazione per il desorbimento, ragione per cui il tampone di eluizione preriscaldato migliora tipicamente la resa del 10–30% rispetto all'eluizione a temperatura ambiente, come osservato in confronti diretti.
La dimensione del frammento modula l'efficienza di legame attraverso un semplice argomento di area superficiale: molecole di DNA più lunghe presentano più gruppi fosfato per molecola, consentendo un attacco multivalente alla superficie della silice. Questo spiega perché il recupero di frammenti al di sotto di 100 bp cala bruscamente—ci sono semplicemente meno contatti fosfato-silanolo a trattenere ciascun frammento corto sulla membrana. Il limite pratico è tipicamente indicato a 50–100 bp, al di sotto del quale i recuperi scendono al 20–60% a seconda del protocollo specifico e della composizione del caotropo.
2. Architettura a Strati: Area Superficiale, Resistenza al Flusso e il Compromesso Legame-Eluizione
Il termine "strato" in una colonna a centrifugazione di silice si riferisce al numero di dischi di membrana di silice impilati all'interno dell'alloggiamento della colonna. Non si tratta di un semplice dettaglio di fabbricazione—esso determina l'area superficiale di legame disponibile, la resistenza al flusso incontrata dal campione durante la centrifugazione e, in ultima analisi, la capacità di legame e la portata della colonna. Per comprendere perché il numero di strati sia importante, è necessario esaminare la fluidodinamica che governa il flusso attraverso una membrana porosa.
La legge di Darcy descrive il flusso di un liquido attraverso un mezzo poroso:
Q = (kAΔP) / (μL)
dove Q è la portata volumetrica, k è la permeabilità della membrana di silice, A è l'area della sezione trasversale, ΔP è la caduta di pressione attraverso la membrana (generata dalla forza centrifuga), μ è la viscosità del fluido e L è lo spessore della membrana. Ogni strato aggiuntivo di silice aumenta L, riducendo Q proporzionalmente per una data velocità angolare e geometria della colonna. Questo è il motivo per cui le colonne a 8 strati richiedono tempi di centrifugazione più lunghi o forze g più elevate per ottenere la stessa portata di campione di una colonna a 4 strati.
Tuttavia, l'aumento di L aumenta anche l'area superficiale totale disponibile per il legame del DNA. La membrana di silice è una rete porosa tridimensionale con un'area superficiale specifica tipicamente nell'intervallo di 200–500 m2/g, a seconda della dimensione delle particelle di silice e della densità di impaccamento. Raddoppiare il numero di strati raddoppia approssimativamente i siti di legame disponibili—ma solo fino al punto in cui le molecole di DNA nel campione hanno tempo e prossimità sufficienti per interagire con la superficie della silice. A basse concentrazioni di caotropo o con tempi di contatto brevi, gli strati più interni della membrana possono contribuire con poca capacità aggiuntiva perché le molecole di DNA vengono catturate dagli strati più esterni prima di raggiungere l'interno.
Questa limitazione cinetica spiega un fenomeno frequentemente osservato: la capacità di legame non scala perfettamente in modo lineare con il numero di strati. Una colonna a 6 strati può offrire circa 1,5–2× la capacità di una colonna a 4 strati per il DNA plasmidico, ma una colonna a 8 strati può fornire solo 2,5–3× la capacità della colonna a 4 strati anziché il 2× che un ridimensionamento ingenuo prevederebbe dal rapporto 4-a-6 strati. I rendimenti decrescenti derivano dal fatto che il tasso di cattura del DNA è concentrato nella porzione prossimale della membrana—il primo strato incontrato dal campione lega la frazione maggiore, e ogni strato successivo incontra una concentrazione di DNA progressivamente ridotta.
La resistenza al flusso impone anche vincoli pratici. All'aumentare di L, il tempo di centrifugazione richiesto per il passaggio completo del campione e dei tamponi di lavaggio attraverso la colonna aumenta. Nella configurazione a 4 strati, i tempi di centrifugazione tipici sono di 30–60 secondi a 10.000–13.000 × g. Nella configurazione a 8 strati, possono essere necessari tempi di centrifugazione di 60–120 secondi. Un tempo di centrifugazione insufficiente è una delle cause più comuni di trascinamento residuo di etanolo, che deprime i rapporti A260/A230 e inibisce le reazioni enzimatiche a valle.
3. Tre Configurazioni e la Loro Logica Biochimica
Le colonne a centrifugazione di silice commerciali sono tipicamente offerte in tre configurazioni di strati, ciascuna ottimizzata per una classe distinta di compiti di purificazione. La logica discende in maniera diretta dalla chimica fisica descritta in precedenza.
4 Strati: Purificazione di Prodotti PCR
La colonna a 4 strati è il cavallo da tiro per la pulizia post-enzimatica. I prodotti PCR variano tipicamente da 100 bp a diverse kilobasi e sono presenti in soluzione a concentrazioni di 10–100 ng/μL dopo l'amplificazione. La capacità di legame richiesta è modesta—tipicamente 5–10 μg per colonna—e la sfida principale è la rimozione efficiente di primer non incorporati (tipicamente 18–30 nucleotidi), dNTP, polimerasi e sali del tampone. La configurazione a 4 strati fornisce un'area superficiale sufficiente per una cattura completa riducendo al minimo lo spessore della membrana che prolungherebbe il tempo di centrifugazione e aumenterebbe il rischio di ritenzione di caotropo.
Per l'estrazione da gel—dove il DNA deve essere recuperato da agarosio fuso—la configurazione a 4 strati è nuovamente preferita. L'agarosio disciolto in tampone di legame caotropico forma una soluzione viscosa che attraversa più facilmente pile di membrana più sottili. Una colonna a 8 strati utilizzata per l'estrazione da gel spesso produce residui di agarosio visibili sulla superficie della membrana a causa dell'intasamento prematuro degli strati superiori, riducendo la resa del 10–20% rispetto alla configurazione a 4 strati.
Il recupero per frammenti superiori a 100 bp supera tipicamente l'80% in condizioni ottimizzate (rapporto corretto tampone di legame:campione, pH 5,0–6,0 nel tampone di legame). Al di sotto di 70 bp, il recupero cala bruscamente—a circa il 40–60% a 50 bp e al di sotto del 20% per frammenti inferiori a 40 bp. Questo limite inferiore di dimensione è governato dal numero di interazioni fosfato-silanolo per molecola piuttosto che da un effetto fisico di dimensione dei pori, poiché i pori della membrana di silice (tipicamente 5–50 nm) sono molto più grandi anche delle più grandi molecole di acido nucleico.
6 Strati: Miniprep di DNA Plasmidico
La purificazione di plasmidi presenta una sfida fondamentalmente diversa. Una coltura tipica di E. coli overnight da 1–5 mL contiene 2–20 μg di DNA plasmidico insieme a milligrammi di DNA genomico, RNA, proteine e detriti della parete cellulare. Il metodo di lisi alcalina, che Birnboim e Doly svilupparono nel 1979, denatura selettivamente il DNA genomico e le proteine lasciando il plasmide superavvolto in soluzione; tuttavia, il lisato neutralizzato contiene ancora contaminanti sostanziali che competono per i siti di legame della silice.
La colonna a 6 strati fornisce una maggiore area superficiale di legame per accogliere la massa più elevata dell'analita, tollerando al contempo la matrice complessa del lisato. La capacità di legame è stimata a circa 20 μg di DNA plasmidico per colonna in condizioni standard, con rapporti A260/A280 costantemente nell'intervallo 1,8–2,0 allorché le fasi di lavaggio vengono eseguite correttamente. Gli strati aggiuntivi migliorano inoltre la rimozione del caotropo residuo e dell'etanolo durante le fasi di lavaggio—aspetto fondamentale per il DNA plasmidico destinato alla trasfezione o alla trascrizione in vitro, laddove anche tracce di contaminazione da etanolo possono risultare citotossiche o inibitorie.
Un parametro spesso trascurato è il rapporto tra volume di coltura e capacità della colonna. Il sovraccarico—elaborare più di 5 mL di coltura plasmidica ad alto numero di copie su una singola colonna a 6 strati—porta a contaminazione da DNA genomico, visibile come uno striscio ad alto peso molecolare sopra la banda superavvolta su gel di agarosio. Tale fenomeno si verifica allorché la capacità di legame viene superata e gli acidi nucleici in eccesso, che normalmente verrebbero eliminati con il lavaggio, saturano invece la membrana e impediscono il corretto lavaggio dei frammenti genomici legati in modo aspecifico.
8 Strati: Estrazione di DNA Genomico e RNA Totale
L'estrazione di DNA genomico da tessuti, cellule in coltura o sangue intero rappresenta l'applicazione più impegnativa per le colonne di silice. La molecola bersaglio è di grandi dimensioni (tipicamente frammenti di 20–200 kb dopo la frammentazione durante la lisi), è presente in quantità di microgrammi (5–50 μg attesi da 106 cellule di mammifero) e deve essere separata da una miscela complessa di proteine denaturate, lipidi e polisaccaridi. La massima area superficiale della membrana della colonna a 8 strati risulta essenziale per catturare l'intera massa di DNA genomico senza saturazione.
La capacità di legame di una colonna a 8 strati è tipicamente di 30–50 μg per il DNA genomico. Per l'estrazione di RNA totale—laddove la molecola è a singolo filamento e presenta pertanto meno contatti di legame per nucleotide—la capacità può raggiungere 50–100 μg, riflettendo la maggiore massa di RNA che può essere accolta per unità di area superficiale grazie alla struttura ripiegata più compatta delle molecole di RNA in soluzioni caotropiche.
Una distinzione critica tra l'estrazione di DNA genomico e di RNA è la composizione del caotropo. Il legame del DNA risulta robusto in un intervallo di sali di guanidina che include GuHCl e GuSCN, mentre il legame dell'RNA è significativamente potenziato dalla guanidina tiocianato, la quale è anche un potente inibitore delle RNasi. La combinazione di GuSCN con β-mercaptoetanolo (o DTT) nel tampone di lisi denatura simultaneamente le RNasi, solubilizza il tessuto e favorisce il legame RNA-silice—una tripla funzione che spiega perché i protocolli basati su GuSCN dominino i flussi di lavoro di estrazione dell'RNA totale. Si noti che le colonne utilizzate per il lavoro con RNA devono essere certificate DNasi/RNasi-free e manipolate con guanti per prevenire la contaminazione ambientale da RNasi, poiché le colonne di silice non discriminano tra i tipi di acidi nucleici—legano RNA e DNA con efficienza comparabile in condizioni caotropiche identiche.
4. Colonne di Silice vs. Metodi di Purificazione Alternativi
Le colonne a centrifugazione con membrana di silice occupano una posizione specifica nel panorama della purificazione degli acidi nucleici, definita da compromessi in termini di resa, purezza, velocità, scalabilità e costo. Una comprensione quantitativa di questi compromessi consente una selezione razionale del metodo.
| Metodo | Resa Tipica | Purezza (A₂₆₀/A₂₈₀) | Tempo | Portata | Costo/Prep | Pericolo |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Colonna a Centrifugazione di Silice | 70–95% | 1,8–2,0 | 10–20 min | 24–48 | $0,30–1,00 | Caotropo (irritante) |
| Fenolo-Cloroformio | 80–98% | 1,7–1,9 | 60–90 min | 12–24 | $0,10–0,30 | Elevato (tossico, cancerogeno) |
| Biglie Magnetiche | 75–95% | 1,8–2,0 | 15–30 min | 96–384 | $1,00–3,00 | Nessuno (automatizzato) |
| Resina a Scambio Anionico | 85–98% | 1,85–2,05 | 30–45 min | 12–24 | $1,50–4,00 | Basso |
| Solo Precipitazione | 50–90% | 1,4–1,8 | 30–60 min | 24–96 | $0,05–0,15 | Nessuno |
Le colonne di silice offrono il compromesso migliore tra velocità, purezza e costo per la maggior parte dei flussi di lavoro di routine in laboratorio. L'estrazione con fenolo-cloroformio produce ancora le rese più elevate—in particolare per grandi frammenti di DNA genomico—ma i pericoli e i requisiti di manodopera l'hanno relegata in gran parte a protocolli specializzati. I metodi basati su biglie magnetiche dominano i flussi di lavoro ad elevata portata e automatizzati (formati a 96 e 384 pozzetti), sebbene a un costo per campione significativamente più elevato. La cromatografia a scambio anionico produce il DNA di purezza più elevata, con rapporti A260/A280 che superano regolarmente 1,90 e livelli di endotossina inferiori a 0,1 EU/μg—il metodo preferito per il DNA plasmidico destinato ad applicazioni di grado trasfezione e vettori di terapia genica clinica. La semplice precipitazione alcolica senza una fase di legame in fase solida produce DNA di purezza insufficiente per la maggior parte delle reazioni enzimatiche e dovrebbe essere riservata alla concentrazione in massa di campioni già purificati.
5. Ottimizzazione del Protocollo: pH, Concentrazione di Caotropo e Trascinamento di Etanolo
Nonostante l'apparente semplicità del processo legame-lavaggio-eluizione, diversi parametri esercitano un'influenza critica sulle prestazioni e vengono regolarmente trascurati nei protocolli standard. Si esaminano di seguito i fattori più rilevanti.
pH del tampone di legame. Il pH ottimale per il legame del DNA mediato dalla silice è 5,0–6,5. Al di sotto di pH 5,0, la depurinazione del DNA diventa significativa, in particolare a temperature elevate, mentre al di sopra di pH 6,5, la superficie della silice acquisisce una maggiore densità di gruppi silanolo deprotonati (pKa del silanolo ≈ 4,5–7,0 a seconda dell'ambiente locale), aumentando la repulsione elettrostatica e riducendo l'efficienza di legame. I tamponi di legame commerciali sono tipicamente formulati con acetato di sodio o Tris-acetato per mantenere questo ristretto intervallo ottimale.
Rapporto caotropo:campione. La concentrazione finale di caotropo dopo la miscelazione del tampone di legame con il campione deve superare circa 3 M per un legame efficiente. Per la purificazione di PCR—dove il campione è prevalentemente acquoso—un rapporto 5:1 di tampone di legame rispetto al campione è standard, producendo una concentrazione finale di GuHCl di circa 4–5 M. Per i frammenti di gel di agarosio, si utilizza un rapporto 3:1 (tampone:gel, v/p), con incubazione a 50–60 °C per dissolvere l'agarosio prima del caricamento. La sotto-concentrazione di caotropo è una causa comune di bassa resa—il DNA rimane idratato e passa attraverso la colonna senza legarsi.
Contenuto di etanolo nel tampone di lavaggio. Il tampone di lavaggio contiene tipicamente il 70–80% di etanolo, il quale mantiene lo stato disidratato del complesso DNA-silice dissolvendo al contempo i sali residui. Concentrazioni di etanolo inferiori al 60% comportano il rischio di un'eluizione prematura del DNA durante la fase di lavaggio. Al contrario, la rimozione incompleta dell'etanolo—dovuta a tempo di centrifugazione insufficiente, provette di raccolta sovraccariche che toccano l'uscita della colonna o impiego di etanolo freddo (la cui viscosità è più elevata)—lascia etanolo residuo nell'eluato. Anche l'1–2% (v/v) di etanolo può inibire la Taq polimerasi e la T4 DNA ligasi, producendo PCR o ligazioni fallite che vengono spesso erroneamente attribuite al fallimento dei reagenti. Una centrifugazione a secco aggiuntiva (2–3 minuti alla massima velocità con la provetta di raccolta svuotata) dopo la fase di lavaggio finale elimina tale variabile.
Cinetica di eluizione. La raccomandazione standard di "aggiungere il tampone di eluizione al centro della membrana e incubare per 1–5 minuti" si basa sulla cinetica di diffusione. La penetrazione dell'acqua nella matrice di silice, il desorbimento del DNA e la diffusione dalla membrana verso la soluzione sovrastante richiedono tempo. L'incubazione a 55–70 °C riduce il tempo richiesto da 5 minuti a 1–2 minuti, aumentando il coefficiente di diffusione del DNA attraverso i pori della membrana. Per il massimo recupero con volume minimo, si consiglia un'eluizione in due fasi—eluendo dapprima con il 50% del volume finale desiderato, centrifugando e quindi ripetendo l'operazione con il restante 50%—che può aumentare il recupero totale del 10–20% rispetto a un'eluizione in singola fase di uguale volume totale.
6. Problemi Comuni e Risoluzione Basata sull'Evidenza
| Sintomo | Causa Più Probabile | Azione Correttiva |
|---|---|---|
| Bassa resa (<50%) | Tampone di legame / concentrazione di caotropo insufficiente | Verificare il rapporto tampone di legame:campione; controllare il pH del tampone (dovrebbe essere 5,0–6,5) |
| Basso A260/A230 (<1,8) | Caotropo residuo o trascinamento di etanolo | Aggiungere una centrifugazione a secco extra (2–3 min); assicurarsi che l'uscita della colonna non tocchi il liquido nella provetta di raccolta |
| Basso A260/A280 (<1,7) | Contaminazione da proteine | Ridurre il campione in ingresso; garantire lisi e neutralizzazione complete; aggiungere una fase di lavaggio extra |
| Alto A260/A280 (>2,2) | Contaminazione da RNA nella preparazione di DNA | Aggiungere trattamento con RNasi A durante la lisi; per DNA genomico, includere la fase con RNasi prima del legame |
| Il gel mostra uno striscio di DNA genomico sopra la banda plasmidica | Sovraccarico della colonna; volume di coltura ha superato la capacità | Ridurre il volume di coltura a 1–3 mL per plasmidi ad alto numero di copie; dividere su più colonne |
| La colonna si intasa / nessun flusso | Dissoluzione incompleta dell'agarosio; viscosità eccessiva del campione | Garantire la fusione completa dell'agarosio a 50–60 °C; diluire i lisati viscosi con tampone di legame aggiuntivo |
| Scarso recupero di piccoli frammenti (<200 bp) | Contatti di legame insufficienti; concentrazione di etanolo troppo bassa | Aggiungere isopropanolo alla miscela di legame (1 volume); ridurre il volume di eluizione; utilizzare un protocollo specializzato per frammenti corti |
| PCR/ligazione a valle fallita | Inibizione da etanolo residuo | Aggiungere centrifugazione a secco di 2–3 min; asciugare la colonna all'aria a temperatura ambiente per 5 min prima dell'eluizione; utilizzare etanolo di recente preparazione |
7. Matrice Decisionale di Selezione
Nella tabella seguente si riassume la configurazione di colonna raccomandata per applicazione, tipo di campione e massa di DNA attesa. Si utilizzi tale tabella come punto di partenza, non come prescrizione rigida—variabili specifiche del protocollo, quali il metodo di lisi, la formulazione del caotropo e il produttore della colonna, possono modificare queste raccomandazioni.
| Applicazione | Fonte del Campione | Resa Attesa | Strati Raccomandati | Dimensione del Frammento |
|---|---|---|---|---|
| Purificazione PCR | Miscela di reazione PCR (25–100 μL) | 0,1–5 μg | 4 Strati | 100 bp–10 kb |
| Estrazione da gel | Frammento di gel di agarosio | 0,05–2 μg | 4 Strati | 100 bp–10 kb |
| Purificazione reazione enzimatica | Digestione di restrizione, ligazione, marcatura | 0,1–2 μg | 4 Strati | Qualsiasi |
| Miniprep plasmidica (alto numero di copie) | E. coli, 1–5 mL coltura LB | 2–20 μg | 6 Strati | 3–15 kb (plasmide) |
| Miniprep plasmidica (basso numero di copie) | E. coli, 1–5 mL coltura LB | 0,5–5 μg | 6 Strati | 3–20 kb (plasmide) |
| DNA genomico (cellule) | Cellule di mammifero in coltura (10⁵–10⁷) | 5–30 μg | 8 Strati | 20–200 kb |
| DNA genomico (tessuto) | Tessuto animale/vegetale (5–25 mg) | 2–20 μg | 8 Strati | 20–150 kb |
| DNA genomico (sangue) | Sangue intero (200–500 μL) | 3–15 μg | 8 Strati | 20–100 kb |
| Estrazione RNA totale | Cellule in coltura (10⁵–10⁷) | 5–50 μg | 8 Strati | Tutti (18S/28S intatti) |
| DNA/RNA virale | Siero, plasma, surnatante (200 μL) | 0,01–1 μg | 8 Strati | Variabile |
8. Risorse Aggiuntive
Per i ricercatori che desiderano reperire materiali di consumo affidabili, MUHWA Scientific offre colonne a centrifugazione con membrana di silice nelle configurazioni a 4, 6 e 8 strati, ciascuna ottimizzata per le applicazioni discusse in precedenza. Tutte le colonne sono certificate DNasi/RNasi-free e confezionate in 100 pezzi per confezione.
Per ulteriori letture sulla metodologia di purificazione degli acidi nucleici, consultare Boom et al. (1990) Journal of Clinical Microbiology 28(3):495–503 per il metodo fondante silice-caotropo; Vogelstein & Gillespie (1979) PNAS 76(2):615–619 per il protocollo originale di recupero del DNA con polvere di vetro; e le linee guida MIQE (Bustin et al., 2009) Clinical Chemistry 55(4):611–622 per le migliori pratiche di PCR quantitativa, inclusa la valutazione della qualità degli acidi nucleici.
Esclusione di responsabilità: Questo articolo è solo a scopo educativo e informativo. I protocolli devono essere validati per tipi di campione e applicazioni a valle specifici. Le specifiche del prodotto sono fornite dal produttore e possono variare in base al lotto. Questo prodotto è conforme ai requisiti del Regolamento UE 2017/746 (IVDR) relativo ai dispositivi medico-diagnostici in vitro e al D.Lgs 169/2004.
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